佐剂是疫苗的组成部分，可以增强疫苗的广度、广度和持久性免疫反应。自20世纪90年代以来，除明矾外，科学家又发现了5种可使用在疫苗中的佐剂，但是对这些佐剂工作的分子机制只是部分理解。模式识别受体(PRRs)的发现和研究为新型佐剂，尤其是分子佐剂的开发带来了新的思路。PRRs是一类表达于固有免疫细胞并可识别病原体相关分子模式(PAMPs)PAMPs的识别分子。PRRs主要包括Toll样受体(TLRs)、NOD样受体(NLRs)、RIG-I样受体(RLRs)、清道夫受体(SRs)、甘露糖受体(MRs)和髓系细胞触发受体(TREMs)等。近来，很多分子佐剂的开发得益于PRRs研究的进步。分子佐剂是指那些能非特异性改变或增强机体对抗原特异性免疫应答的各种免疫相关分子和本身就具有免疫刺激效应的分子。在文章中，我们回顾“已知知识”和“已知未知”的佐剂，讨论这些新兴的概念，并强调随着先天免疫和系统疫苗学的知识不断扩展，正在振兴用于预防COVID-19和未来大流行疫苗的新型佐剂的科学和开发。许可疫苗中的佐剂虽然只有少数佐剂可用于临床，但现在很明显，许多已在数十亿人中安全使用的疫苗中含有内源性佐剂。天然免疫和关键天然受体PRRs的描述在概念上取得了重大进展，使人们认识到许多广泛使用的活疫苗部分通过激活特异性PRRs23诱导免疫应答。这些疫苗由活的减毒病原体组成，通过表达各种PAMPs激活先天免疫。例如，黄热病减毒活疫苗（YF-17D）是迄今为止开发并向全球6亿人接种的最有效的疫苗之一，它通过多种tlr（TLR2，TLR3和TLR7–TLR9）以及通过RIG-I和黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）（图1）。重要的是，TLR信号对于YF-17D的免疫原性，但不应低估减毒病毒复制过程中持续抗原表达的额外影响。同样，卡介苗-盖林（卡介苗）结核疫苗，其中超过40亿剂已经接种，激活TLR2，TLR4，TLR9和CD抗原（也称为DC-SIGN）。此外，某些灭活疫苗也会触发TLRs，例如季节性流感疫苗。这些发现进一步指出了TLR激动剂作为佐剂设计的关键靶点的持续合理发展，特别是在不含内源性佐剂的亚单位疫苗中。许多研究已经证明合成TLR配体作为疫苗佐剂在小鼠和非人灵长类动物（NHPs）中的有效性，在用重组蛋白抗原、病毒样颗粒或DNA编码抗原进行疫苗接种时促进增强和更持久的抗体应答。事实上，活病毒疫苗通常能诱导人类产生强烈和持久的抗体反应，这就增加了用灭活疫苗注射佐剂也能诱导这种强烈和持久的抗体反应的可能性。在发现黄热病疫苗通过多种TLR配体24与多种DC亚群结合的基础上，我们设计了含有TLR4和TLR7/TLR8配体作为佐剂的合成纳米颗粒，用于与可溶性蛋白抗原（如鸡卵清蛋白或流感血凝素）结合使用。最近的研究表明缓释给药系统以延迟动力学释放抗原的（如渗透泵）可提高抗体反应的幅度、质量和持久性。虽然这是由于淋巴结中抗原滞留时间较长导致GC反应增强所致，但佐剂对天然细胞持续激活的效果尚未完全评估。在这种情况下，我们和其他人发现3M-，一种新的TLR7/TLR8激动剂，从给药部位缓慢释放，导致单核细胞和DC的激活，持续3-4周，并且诱导持续的抗体反应和LLPC，其幅度比alum观察到的要大得多（高达倍），持续到免疫后70周研究终止。明矾明矾是最常用的佐剂和用于人类的诱导抗体反应和CD4+T辅助细胞反应（表1）。这些辅助性T细胞反应在小鼠中是辅助性T细胞2（TH2）的偏向性，但在人类中这种偏向性不太清楚。长期以来，人们一直认为明矾主要通过“仓库效应”机制介导其佐剂效应，该机制涉及免疫部位抗原的缓慢释放。明矾实际上对免疫系统有几种作用系统。如上所述，尽管TLR似乎对活病毒疫苗的免疫原性至关重要如黄热病疫苗YF-17D免疫刺激的免疫反应明矾加抗原对缺乏这种抗体的小鼠没有影响参与TLR信号传导的关键衔接蛋白：MyD88或TIR域包含适配器干扰素β（TRIF）。这表明佐剂的作用明矾的溶解是通过一种独立于TLR信号。后来的研究表明，明矾激活了NLRP3炎症体，尽管相关的介导明矾佐剂作用中的相对重要性的数据是矛盾的。明矾还可以通过引起组织损伤，诱导尿酸介导的炎症DCs激活，从而增强适应性免疫。例如，在小鼠中，抗原加明矾诱导免疫细胞死亡和随后释放的宿主细胞DNA，刺激抗原特异性IgE反应TH2细胞反应。TH2细胞反应与通过依赖于坦克结合激酶1（TBK1）和转录因子IRF3，这是信号的关键组成部分由细胞溶质DNA传感器STING62介导的途径（表1）。明矾也用于灭活病毒COVID-19疫苗，有某些国家已被批准用于有限或紧急用途（表2）。因此，明矾的作用机制是复杂的，在小动物中可能有几个因素同时起作用，配方的作用不容忽视。MF59佐剂MF59佐剂的研究始于20世纪80年代末期。在当时重组DNA背景下，许多新的蛋白质抗原都可以用于疫苗制备。以角鲨烯为例，这是一种从鲨鱼肝脏中提取的油，也是佐剂MF59的关键成分，已被用于季节性流感疫苗中。MF59被认为是通过刺激附近细胞分泌趋化因子（信号转导），以促使其他细胞产生更多的趋化因子而起作用的。这个连锁反应最终可吸引到免疫细胞，帮助人体识别病原体。AS系列佐剂AS（adjuvantSystem,AS）佐剂是葛兰素史克（GlaxoSmithKline,GSK）公司研制的系列人用疫苗佐剂，分为AS01、AS02、AS03和AS04.目前，已有7种新型佐剂被批准应用于人体疫苗，分别是ⅤIrosomesMF59、Imiquimod、Resiquimod、AS0l、AS03和AS04.这些新型佐剂的出现打破了铝佐剂在人用疫苗佐剂中“一花独秀”的局面。尽管已经确定佐剂可以增强人类对疫苗接种的抗体反应，但迄今为止，尚未显示佐剂能够诱导由活病毒疫苗（例如YF-17D）刺激的抗原特异性CD8+T细胞反应的程度。有人认为，抗原的初始剂量和持久性是CD8+T细胞反应的主要决定因素。然而，对人类活病毒疫苗诱导的免疫反应的分析表明，抗原负荷和佐剂信号均在诱导适应性免疫反应中起关键作用。胞嘧啶磷酸鸟苷TLR9有三类CpG寡核苷酸配体，可通过不同的核苷酸序列基序及其刺激浆细胞DCs中IFNα的能力来区分（表1）。TLR9激动剂CpG是一种22-mer非甲基化CpG-B类寡核苷酸，是一种有效的TH1细胞佐剂，可刺激B细胞和NK细胞的强烈活化。CpG目前正在临床试验中作为COVID-19疫苗的潜在疫苗佐剂进行评估（表2）。佐剂与CD8+的T细胞在小鼠中，几种免疫原与一系列佐剂结合可诱导有效的CD8+T细胞反应。相比之下，在人类中，只有活的病毒疫苗，例如黄热病和天花，才能诱导非常高的抗原特异性效应CD8+T细胞反应和记忆CD8+T细胞反应。由于这些是复制型疫苗，因此这些研究突显了初始病毒载量（抗原）决定了人类CD8+T细胞反应的强度。在YF-17D小鼠中进行的实验表明，DC的激活通过多个TLR和由此产生的MyD88信号驱动CD8+T细胞的诱导。此外，YF-17D通过RNA传感器RIG-1和MDA5发出信号。因此，需要解决的一个重要问题是是否存在佐剂可以模拟活疫苗在诱导人CD8+T细胞反应中的功效。经验表明，即使与强效佐剂一起运送，亚单位疫苗也不会诱导人CD8+T细胞反应，至少在血液中可以测量到。这不仅仅是DCs的问题树突状细胞一直被认为是主要的细胞靶点疫苗佐剂。事实上，有明确的证据表明，树突状细胞是必需的佐剂活性TLR配体。因此，在缺乏树突状细胞的小鼠中，TLR配体的佐剂活性严重受损。即使对于非TLR为基础的佐剂如明矾或MF59，DC或DC亚群的条件性缺失也会导致适应性免疫反应的严重损害。这些研究已经明确地将树突状细胞作为敏感佐剂和调节适应性免疫的关键细胞类型之一。然而，免疫系统是一个由相互作用的细胞类型组成的复杂网络，尽管树突状细胞在先天感应和协调免疫反应中起着核心作用，但新的证据突出了其他细胞类型在这一过程中的关键作用。例如，如前所述，明矾和MF59的施用在肌肉细胞中诱导转录改变，比在树突状细胞中诱导更大。MF59诱导的肌细胞ATP释放对其佐剂活性至关重要。未来的工作应着眼于更全面地评估不同类型的细胞参与佐剂的天然感觉，以及它们协调适应性免疫反应的机制。这也不仅仅是TLR的问题尽管过去十年中佐剂发现的主要焦点是靶向TLR途径，但现在很清楚，其他prr可以靶向实现佐剂效应。新一代佐剂可能开发的受体包括NLRs、RIG-I样受体（RLRs）、CLRs和STING配体。值得注意的是，通过大多数PRRs（包括TLRs）发出的信号会引起局部组织和细胞损伤，由此释放的damp似乎是几种佐剂活性的关键组成部分。例如，细菌PAMPs的胞浆传感器NLRs识别多种细胞产物，包括ATP、尿酸和K+外流，表明这种激活可能由细胞损伤介导。Chen等人最近发现，环状RNA在体内激活RIG-I，可以作为一种佐剂来诱导细胞介导和抗体反应。当表达的抗原在细胞内被主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类有效呈递时，进一步评价环状RNA编码蛋白是否能诱导更强、更有效的CD8+T细胞应答将是一个有趣的问题。代谢、细胞死亡与表观遗传学在过去的十年里，人们越来越清楚地认识到，先天免疫系统不仅可以通过PRRs感知微生物，而且还能够感知各种组织损伤和应激信号。例如，组织损伤可由创伤、自身免疫或感染引起，并导致细胞死亡和细胞外释放过多的湿气，如ATP或尿酸，或DNA或RNA片段或高迁移率族框1（HMGB1），其可激活DC以刺激适应性免疫。这就提出了这样一个问题：这些天然活化途径是否可以在设计新型佐剂时加以利用。事实上，有新的证据表明，已经在临床上使用的佐剂确实可以通过这种途径刺激免疫反应（图2a）。细胞死亡佐剂细胞死亡也已成为免疫反应的关键调节因子。Bevan及其同事的早期研究表明，通常不能进入DCs细胞质的外源性抗原可以转移到细胞质中，在那里它们可以被加工或呈现在MHCⅠ类细胞上，以刺激CD8+T细胞免疫。许多实验室的后续工作帮助建立了DC抗原递呈的途径，并证明DC也可以从凋亡细胞获得抗原，将这些抗原交叉递呈给CD8+T细胞。然而，过去十年的研究已经揭示了细胞死亡的多种方式，许多工作都集中在了解坏死的机制上。有趣的是，RIPK3介导的对CD8+T细胞的刺激是通过一种独立于MLKL的机制发生的，提示RIPK3介导CD8的活化+T细胞通过非坏死性上睑下垂的机制（图2b）。代谢佐剂另一个近年来发展势头强劲的概念是，骨髓细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）的代谢状态可以规划其固有反应和刺激T细胞的能力。因此，处于不同成熟阶段或不同组织中的dc具有不同的代谢状态。例如，中枢代谢调节剂mTOR复合物在介导TLR诱导的浆细胞样DC分泌I型干扰素中起主要作用，影响髓系DC中的IL-12分泌，并在代谢上重新编程肺DC以使过敏性炎症从嗜酸性TH2向嗜中性TH17细胞极性倾斜，通过一种导致IL-23和脂肪酸氧化增强的机制。表观遗传佐剂最近出现的另一个概念是先天免疫记忆或“训练免疫”。有人提出，骨髓细胞，如单核细胞和巨噬细胞或NK细胞，在受到PAMPs刺激后获得记忆样特征。这种“先天记忆”依赖于持续的表观遗传程序设计，这种程序设计是由一级刺激引起的，在二级刺激后，细胞要么反应过度，要么反应低下。疫苗（如卡介苗）和PAMP（如β-葡聚糖）在单核细胞和巨噬细胞中诱导组蛋白H3在Lys4处三甲基化（H3K4me3）和H3在Lys27处乙酰化（H3K27ac）（图2d）。我们可以设想靶向单核细胞或其他髓细胞的小分子经历表观遗传重编程，刺激先天反应的特定方面的高度激活，例如一种抗病毒的状态，能增强对病毒的抵抗力病毒，在一段时间内，也许几个星期左右。这样的表观遗传佐剂可以用来印迹增强的抗病毒状态，赋予对病毒的抵抗力人类中广泛存在的病毒。在易感人群中，在诸如COVID-19等大流行期间，使用这种表观遗传佐剂在可能数周的有限时间内增强抗病毒抵抗力是特别有利的。佐剂配方的功效合成分子与天然产物。尽管目前最成功的佐剂，包括许可产品中的佐剂，主要由来自天然来源的成分组成，但我们并不认为这必然反映了21世纪初“成功”的最佳途径。必须承认，最成功的佐剂中所用的成分在年代初和以前普遍可用。他们是最好的材料，因为他们是随时可用和有效的。然而，现在人们越来越认识到先天免疫对佐剂作用的关键作用，合成化学促进了新分子的发展，这种分子可以更好地设计为纯激动剂。虽然最初的计划集中在发现TLR激动剂，寻找其他天然激活系统的新激动剂很快随之而来。这些新发现的佐剂的固有特性使它们比它们可能取代的原始天然分子更适合产品开发。建立公式与创建新的公式方法由于这种小分子激动剂从微粒呈现中受益匪浅，化学操作可使其适合配制成优选的递送系统，具有溶解性和相容性方面的灵活性。最近对动物模型的研究强调了纳米颗粒疫苗的价值有几种配方方法已经建立，用于许可产品中的佐剂。其中包括用作吸附剂的不溶性铝盐、易于注射的低含油量、水包油乳剂和脂质体输送系统。只包括必要的东西确保每个组成部分都是必要的，并增加明确的价值，使改进佐剂的合理建设成为可能。AS01是目前许可产品中最成功的佐剂，基于该产品的疗效水平，对水痘带状疱疹的疗效97%。新框架系统疫苗学开发含有新型佐剂的疫苗的既定方法被描述为医学上最慢的过程之一。几十年来，佐剂的开发一直依赖于对候选药物的系统测试小鼠分子研究进展进入NHP模型并最终在人类中进行试验（图4a）。然而，在所有在动物模型中显示出巨大免疫原性和有效性的佐剂中，只有少数证明对人类安全有效。缺乏从老鼠到人类的翻译的一个主要原因是它们在万年前的进化分化，尽管它们的免疫系统具有广泛的相似性（小鼠和人类都有T淋巴细胞和B淋巴细胞），但由此产生的重要免疫差异（如DC亚群中TLR7表达的差异）。这些主要差异强调了在佐剂试验中利用人体模型的必要性。系统疫苗学的最新进展改变了我们探测人类疫苗免疫反应的能力，其精确度达到了前所未有的程度。几十年来，疫苗制造商一直依赖于一种单一的测量方法，通常是血清抗体滴度，来评估疫苗接种的免疫反应。这种方法的一个主要限制是它不能捕捉到疫苗免疫反应的复杂性，因此可能无法确定保护性免疫的相关因素和关键机制。系统疫苗学利用转录组学、代谢组学、高维细胞仪和表观基因组学等高通量技术，全面分析疫苗免疫应答，并利用这些分析产生的数据描绘疫苗免疫的相关因素和机制。在一项独立的研究中，Gaucher等人发现了黄热病疫苗诱导的类似特征，这些特征与随后的适应性免疫反应相关。在这些研究之后，一些小组利用这种方法来研究对其他几种疾病的免疫反应，包括流感、疟疾、脑膜炎球菌和肺炎球菌感染和水痘带状疱疹病毒。重要的是，系统疫苗学方法已被用于确定多个流感季节和不同人群（老年人、糖尿病患者）常见的疫苗诱导特征。这些研究已经确定了与抗体反应的耐久性相关的特征。系统的疫苗学研究已经产生了许多关于疫苗反应机制的新见解。例如，TLR5的表达在接种后几天内被诱导，并与几周后的抗体反应密切相关。随后的小鼠实验显示，TLR5缺陷小鼠对季节性流感疫苗接种的抗体反应受损。这可能是由于来自肠道微生物群的鞭毛蛋白通过TLR5发出信号，并提供佐剂信号以增强抗体反应。因此，接种广谱抗生素治疗的小鼠或无菌小鼠对流感疫苗的抗体反应受损。在这些研究的基础上，我们对人类进行了一项研究，以评估微生物群对季节性流感免疫反应的影响疫苗，通过在季节性流感疫苗接种前后给健康人施用广谱抗生素。这些研究揭示了系统疫苗学方法的威力：这些研究揭示了系统疫苗学方法的威力：首先，在确定人类疫苗反应的分子预测因子方面；然后，在小鼠模型中对其进行实验验证；最后，在一项新的人类研究中检验这些机制的见解。促进佐剂发展一个新的佐剂开发框架可能会更加强调在药物小规模临床试验（0/I期）中测试许多潜在的佐剂概念。因此，新的佐剂可以在小的第一阶段（0期）人体试验和系统疫苗学方法中快速测试，以获得机理的见解。最近一项临床试验的结果表明，COVID-19疫苗与另一种皂甙佐剂Matrix-M1的中和抗体滴度很高，但缺乏关于分子和细胞免疫的详细知识这类皂甙类佐剂的作用机理调解他们的影响。此外，系统的疫苗学方法不仅可以用来确定感染的机制佐剂的作用，也包括哪些配方有效，接种疫苗后不久出现不良反应的潜在机制以及合理设计疫苗的最佳剂型。从0/I阶段研究中获得的结果将有助于机械假说的形成。关于可以在动物模型中测试的佐剂或体外人体类器官培养（图4b）。尽管过去十年来佐剂发现的主要重点一直是针对TLR途径，但现在很明显，其他PRR也可以靶向达到佐剂作用。新一代佐剂潜在利用的可用受体包括NLR，RIG-I样受体（RLR），CLR和STING配体。值得注意的是，通过大多数PRR（包括TLR）发出的信号会诱导一些局部组织和细胞损伤，由此释放的DAMP似乎是几种佐剂活性的关键组成部分。在这里，我们提出了一个改进的新模型，用于新型佐剂的合理设计和迭代测试---一种基于系统疫苗学的跨学科方法加速临床佐剂的发现和发展（图4）。根据我们在管理新佐剂到疫苗产品商业批准方面的经验，我们想强调早期使用人体研究的价值。从这些研究中产生的“组学”数据可以促进关于候选佐剂刺激强大和持久的抗原特异性T细胞和B细胞应答的机制的新假设的形成。这样的假设可以在动物模型中重新测试，随后产生的机理见解可以用来设计新的佐剂概念。在佐剂开发管道的早期阶段，这种利用人体模型与系统疫苗学领域相结合的方法具有变革的潜力。a
当前的开发包含新型佐剂的疫苗的模型代表了从对小鼠中新候选物的系统测试，到有前途的候选物的发展到在非人类灵长类动物（NHP）中进行测试以及在临床试验的多个阶段对人类进行最终测试的线性进展。b
科研人员提出的新模型依赖于在小鼠、器官培养物、NHPs和人类身上进行反复测试的过程。我们建议尽早使用小规模的实验性人体试验，并利用系统生物学方法产生多参数免疫读数，从而生成可在术前模型中重新测试的新假设和辅助概念。
为满足广大疫苗行业从业者对于相关信息发展和经验分享的渴求，中国疫苗行业协会将联合丹纳赫生命科学于4月期间举办两场《后疫情时代新型疫苗研发与生产》系列在线研讨会：1）4月21日第一期：新型疫苗研发方向与新技术应用；2）4月28日第二期：新型疫苗快速产业化挑战与解决思路
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